Las iPSC administradas de forma exógena interrumpen la respuesta de reparación natural de las MPC endógenas después de una lesión ósea

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 9378 (2023) Citar este artículo

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Promover la curación ósea, incluidas las seudoartrosis de fracturas, es un objetivo prometedor para la ingeniería de tejido óseo debido al éxito limitado de los métodos de tratamiento clínico actuales. Se han realizado importantes investigaciones sobre el uso de células madre con y sin andamios de biomateriales para tratar fracturas óseas debido a sus prometedoras capacidades regenerativas. Sin embargo, las funciones relativas de las células madre exógenas frente a las endógenas y su contribución general a la reparación de fracturas in vivo no se conocen bien. El propósito de este estudio fue determinar la interacción entre las células madre exógenas y endógenas durante la cicatrización ósea. Este estudio se llevó a cabo utilizando un modelo estandarizado de lesión ósea con orificio de rebaba en un ratón de rastreo de linaje de células progenitoras mesenquimales (MPC) en condiciones homeostáticas y osteoporóticas normales. Las lesiones por rebabas se trataron con un biomaterial de colágeno-I cargado con y sin células madre pluripotentes inducidas marcadas (iPSC). Utilizando el rastreo de linaje, se examinaron las funciones de las células madre exógenas y endógenas durante la curación ósea. Se observó que el tratamiento con iPSC dio como resultado una cicatrización silenciada en comparación con los controles no tratados en ratones intactos después de la lesión. Cuando las poblaciones de células se examinaron histológicamente, los defectos de agujero de rebaba tratados con iPSC presentaron una reducción drástica de las MPC endógenas y la proliferación celular en todo el sitio de la lesión. Sin embargo, cuando se extirparon los ovarios y se indujo un fenotipo similar a la osteoporosis en los ratones, el tratamiento con iPSC dio como resultado una mayor formación ósea en relación con los controles no tratados. En ausencia de iPSC, las MPC endógenas demostraron una sólida capacidad proliferativa y osteogénica para emprender la reparación y este comportamiento se interrumpió en presencia de iPSC que, en cambio, asumieron un destino de osteoblastos pero con poca proliferación. Este estudio demuestra claramente que las poblaciones de células administradas de forma exógena pueden afectar la función normal de las poblaciones endógenas de tallo/progenitores durante la cascada de curación normal. Estas interacciones deben comprenderse mejor para informar las terapias celulares y biomateriales para tratar las fracturas.

A lo largo de la vida, el hueso se remodela continuamente en respuesta a la carga, los cambios metabólicos y los daños (como las fracturas). En los seres humanos, las fracturas de los huesos largos suelen curarse en un plazo de 3 a 4 meses1. Las células madre/progenitoras esqueléticas, como las células madre/progenitoras mesenquimales (MPC), desempeñan un papel importante en la cicatrización ósea, ya que tienen la capacidad de diferenciarse en muchos de los tipos de células implicados en la cascada de cicatrización (p. ej., condrocitos, osteoblastos y osteocitos). así como influir en el nicho inflamatorio (inmunomodulación) durante el proceso de reparación2.

A pesar de la capacidad intrínseca del hueso para regenerarse después de una lesión, hay varios casos en los que el hueso no puede curarse por sí solo y estas lesiones pueden persistir debido a una variedad de factores, como una mecánica de fractura inestable o enfermedades como la osteoporosis3. En estos casos, puede surgir un defecto que no se repara llamado seudoartrosis de fractura. Las pseudoartrosis de fracturas generalmente se caracterizan por la falta de consolidación en 6 a 8 meses, sin signos progresivos de curación4 y se estima que 100 000 fracturas evolucionan a pseudoartrosis solo en los EE. UU.5. Por lo tanto, promover la curación de las seudoartrosis de fracturas es un objetivo prometedor para la ingeniería de tejidos óseos debido a la incapacidad del defecto para regenerarse, así como a su incidencia clínica relativamente alta.

Debido a sus prometedoras capacidades regenerativas, ha habido una importante investigación sobre el uso de células madre exógenas (adultas y pluripotentes) con y sin andamios de biomateriales para tratar fracturas óseas6,7,8,9. Sin embargo, a pesar del potencial de la terapia con células madre en la reparación de fracturas, todavía falta investigación que investigue la interacción de las células madre/progenitoras exógenas frente a las endógenas durante el proceso de curación de la fractura. Además, aún no está claro a través de qué mecanismos los MPC endógenos contribuyen a la curación de fracturas; existe evidencia de que se diferencian y contribuyen a la formación de tejido nuevo10, así como también pueden contribuir indirectamente mediante la liberación de factores de crecimiento/citocinas para promover la cicatrización6,10,11. Para obtener una mejor comprensión de los mecanismos celulares a través de los cuales se cura el hueso, es necesario determinar cómo las poblaciones de células madre/progenitoras exógenas y endógenas interactúan entre sí durante la curación in vivo. Por lo tanto, el propósito de este estudio fue examinar la interacción entre las células exógenas (células madre pluripotentes inducidas, iPSC) y las células endógenas (MPC) durante la reparación de fracturas para obtener información sobre estos mecanismos con el objetivo de mejorar la curación en fracturas no unidas.

Para evaluar la cicatrización, se generó una lesión por trepanación altamente reproducible en la tibia proximal7,12,13,14, junto con un modelo murino de seguimiento de linaje (Hic1cre-ERT2:RosatdTomato)15,16,17 en el que las MPC endógenas se pueden identificar después -lesión. En este modelo de ratón, las MPC endógenas se marcan permanentemente con tdTomato después de la inducción de tamoxifeno15,16. Para evaluar las células madre exógenas en el proceso de reparación, se trasplantaron iPSC marcadas con proteína fluorescente verde (GFP) incrustadas en un biomaterial de colágeno-I14,18 en el sitio del defecto del agujero de rebaba. Los MPC endógenos y los iPSC exógenos podrían rastrearse simultáneamente durante la curación de la fractura con los marcadores fluorescentes duales. Además de rastrear estas células después de la fractura, también empleamos un modelo osteopénico/porótico (ovariectomía/OVX) para obtener una mejor comprensión del papel de las poblaciones de células madre exógenas y endógenas en la curación del hueso en condiciones homeostáticas intactas frente a no homeostáticas ( enfermedad) condiciones.

Todos los estudios con animales se realizaron de acuerdo con las recomendaciones del Consejo Canadiense de Pautas para el Cuidado de los Animales. El informe de estos datos en el manuscrito sigue las recomendaciones de las directrices ARRIVE. El Comité de Cuidado de Animales de Ciencias de la Salud de la Universidad de Calgary aprobó todos los protocolos y procedimientos quirúrgicos con animales utilizados en este estudio (Ethics ID# AC16-0043).

Se recolectaron embriones C57BL/6 (día 12,5), se enjuagaron en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) y se maceraron. Después del tratamiento con tripsina al 0,25 %, la suspensión de células resultante se filtró para eliminar los desechos y se sembró en DMEM con alto contenido de glucosa (Gibco), FBS al 10 % (Gibco), 1 × MEM de aminoácidos no esenciales (Gibco), 50 unidades/ml de penicilina –Estreptomicina (Gibco). Los fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) resultantes se enviaron a Applied Biological Materials Inc. (Richmond, BC) para la reprogramación celular a fin de producir iPSC. Los MEF se transdujeron con Lentivirus SFFV-OCT4, -SOX2 y -KLF4. Después de una semana, las colonias similares a ESC se transfirieron a pocillos frescos con alimentadores. Después de dos pases en células alimentadoras, las iPSC de ratón se enviaron a UCalgary. Para incorporar GFP en el genoma, se usó CRISPR/Cas9 para insertar un transgén de 6 kb en el locus ROSA26 de puerto seguro del ratón usando la técnica de integración dirigida independiente de la homología (HITI) [136]. Para cada reacción de nucleofección, se usaron 10 μl de ADN CRISPR de 916 ng/μl y 10 μl de ADN de 719 ng/μl de construcción de ADN Cas9 mezclado con 28,98 μl de construcción de GFP de 414 ng/μl para las iPSC. Todas las construcciones de ADN se disolvieron en agua. Para cada reacción de nucleofección, se utilizaron construcciones con tres millones de iPSC con el kit de nucleofección (kit de nucleofección de ratón, Lonza, n.º de catálogo VPH-1001) en el programa A-023 según las instrucciones del fabricante. Las iPSC nucleofectadas se cultivaron en placas recubiertas de gelatina y MEF con medio ESC durante dos días. Luego se realizó FACS con marcador SSEA1. Las iPSC se digirieron enzimáticamente con tripsina al 0,25 % durante 5 min a 37 °C. Las células individuales se lavaron dos veces con DPBS frío y se tiñeron con SSEA1-PE conjugado con una concentración de 1 μg/ml (Santa cruz: sc-21702 PE) durante 15 min. Las iPSC doblemente positivas para GFP y SSEA1 se clasificaron en placas de 96 pocillos recubiertas de gelatina, una célula/pocillo. Los clones se secuenciaron para determinar el posicionamiento y la orientación correctos del transgén en el locus ROSA26. Para validar que las células permanecieran como iPSC funcionales, se realizaron ensayos de teratoma en los que se trasplantaron subcutáneamente 1.106 células en el área dorsal de ratones SCID-beige. Las muestras fueron fijadas, procesadas e incluidas en parafina. Se seccionaron a un espesor de 10 μM y se tiñeron con Safranina O.

Las iPSC murinas se cultivaron de forma rutinaria en fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) inactivados mitóticamente en matraces T25 (Fisher). El medio de cultivo consistía en medio Eagle modificado de Dulbecco con alto contenido de glucosa (DMEM, Lonza) complementado con un 1 % de aminoácidos no esenciales, un 1 % de anti-anti, un 15 % de suero bovino fetal (FBS) y β-mercaptoetanol 0,1 mM (todo Invitrogen) . Para mantener la pluripotencialidad de iPSC, el medio de cultivo se complementó con 1000 U/ml de factor inhibidor de la leucemia (LIF). Las células se pasaron de forma rutinaria al alcanzar aproximadamente el 80 % de confluencia cada tres o cuatro días y se mantuvieron en una incubadora humidificada con CO2 al 5 % a 37 °C. Un paso antes de que las células se añadieran al armazón de colágeno, se cultivaron en matraces recubiertos con gelatina (0,1 %, Fisher) para eliminar el exceso de MEF.

El andamio de colágeno-I se preparó de acuerdo con los métodos publicados previamente7,14,18. Se polimerizó colágeno I fibrilar bovino (3 mg/ml, PureCol, Advanced Biomatrix) como un gel 3D. Brevemente, se mezcló una solución de colágeno tipo I de 3 mg/ml al 80 % v/v con una suspensión de iPSC de 1 millón de células/ml y fosfato de beta-glicerol al 20 % v/v (βGP, Sigma Aldrich) disuelto en solución de Dulbecco modificada 5 × concentrada. Medio de Eagle (DMEM)18. Posteriormente, se añadió FBS al 15 % (Invitrogen), aminoácidos no esenciales al 1 %, Anti-Anti al 1 % y β-mercaptoetanol 0,1 mM (todo Invitrogen)18. La construcción colágeno-I/iPSC se distribuyó en una placa de 96 pocillos con un volumen de 100 μl por pocillo. El andamio polimerizado se colocó en una incubadora a 37 °C y 5 % de CO2 para prediferenciar durante 5 días antes de la implantación in vivo en el modelo animal. Para el control de andamiaje solo de colágeno, también se llevó a cabo el protocolo anterior, sin embargo, no se agregaron las iPSC. En la figura complementaria S1 se muestra una descripción general del proceso.

Los andamios de colágeno-I con iPSC se recolectaron en puntos de tiempo: 0, 1, 3, 5, 8, 11, 13, 15, 18 y 21 días después de la siembra. Se añadió Trizol (Invitrogen) y se usó una aguja de calibre 26 ½ para lisar el colágeno/matriz celular en el Trizol. El ARN se aisló utilizando el protocolo recomendado por el fabricante. El ADNc se preparó utilizando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (ThermoFisher). La RT-PCR se realizó en un ABI QuantStudio 6 usando sondas nuevamente Sp7 (Mm04209856_m1) y Bglap (Mm03413826_mH), Ibsp (Mm00492555_m1), Sox9 (Mm00448840_m1), Col2a1 (Mm01309565_m1), Oct4 (Mm0305 3917_g1), Nanog (Mm02019550_s1) con 18S ( Mm03928990_g1) como control de limpieza.

Las células se disociaron en suspensiones unicelulares con tratamiento con colagenasa I y se sometieron a citometría de flujo usando un software Attune NXT y FlowJo para el análisis. Se registraron al menos diez mil eventos por muestra, y el análisis de células completas se realizó utilizando puertas de dispersión apropiadas para evitar restos y agregados celulares. Las células se tiñeron usando el kit Annexin-PI (ThermoFisher) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Los ratones rastreadores de linaje MPC (Hic1cre-ERT2:ROSAtdTomato) en un fondo C57BL/6 fueron proporcionados por el Dr. T. Michael Underhill (Universidad de Columbia Británica). En este estudio se utilizaron machos y hembras de entre 8 y 12 semanas de edad. El diseño experimental para la lesión ósea en ratones intactos y con ovariectomía (OVX) se representa en la figura complementaria S2.

En este modelo de ratón, las MPC endógenas se marcaron permanentemente con tdTomato después de la inducción de tamoxifeno. Los ratones fueron anestesiados y recibieron inyecciones intraperitoneales del isómero activo de tamoxifeno ((Z)-4-hidroxitamoxifeno, Sigma) disuelto en aceite de girasol esterilizado. Se inyectaron ratones con 100 μl de solución de tamoxifeno (100 mg/kg) una vez al día durante 4 días, seguido de un período de espera de 1 semana para permitir la recombinación.

Una semana después de la última inyección de tamoxifeno, se realizó una herida de trepanación (tamaño no crítico). La lesión por perforación se realizó siguiendo los procedimientos descritos previamente por Taiani et al.12,13,19, que se modificó a partir de los métodos publicados previamente por Uusitalo et al.20 Los ratones se anestesiaron con isoflurano veterinario y se administró 0,1 ml de buprenorfina por vía subcutánea antes. a la cirugía Se utilizó un microtaladro de alta velocidad (Fine Science Tools) para perforar un orificio de 0,7 mm de diámetro en la cavidad medular (sin dañar el lado opuesto) de la metáfisis de la tibia proximal19.

En el modelo de fractura homeostática, los ratones se dividieron en tres grupos: control sin tratar, construcción de colágeno I vacía y colágeno I + iPSC. Inmediatamente después de la lesión por perforación, se grapó la piel de los ratones de control no tratados para cerrar el sitio de la incisión. Para los ratones tratados con colágeno I vacío y colágeno I + iPSC, se implantaron 100 µl de gel con (100.000 iPSC por ratón) o sin células en el defecto del agujero de rebaba. Luego, el sitio de la incisión se cerró con grapas y los ratones se devolvieron a sus jaulas y se les permitió soportar peso inmediatamente después de la cirugía.

Similar al diseño experimental del modelo de curación de fracturas homeostáticas, Hic1cre-ERT2:ROSAtdTomato recibió inyecciones intraperitoneales de tamoxifeno una vez al día durante 4 días. Una semana después de la última inyección de tamoxifeno, los ratones recibieron cirugía OVX. Brevemente, los ratones se anestesiaron y se les administró 0,1 ml de buprenorfina antes de la cirugía. Ambos ovarios fueron localizados y extirpados. Una semana después de la cirugía de OVX, se realizó una cirugía de agujero de trepanación. Los ratones OVX se dividieron en tres grupos: control no tratado con OVX, construcción de colágeno I vacía de OVX y iPSC de OVX y colágeno I +.

Las tibias se descalcificaron, procesaron e incluyeron en cera de parafina y se seccionaron transversalmente a 10 μm. Se realizaron tinciones con safranina-O/fast-green e inmunofluorescencia. Los marcadores específicos utilizados fueron: TdTomato, GFP, Anti-Mo/Rt Ki-67 eFluor 660 Clone SolA15 (Invitrogen, Ki67), Bone sialoprotein (BSP) Clone WVID1(9C5) (Developmental Studies Hybridoma Bank). Los portaobjetos se trataron con EverBrite™ Hardset Mounting Media con DAPI (biotio) y se tomaron imágenes con el microscopio Zeiss Axioscan.

Para el análisis cuantitativo, el área de interés se adquirió como imágenes digitales en escala de grises. Las células de un fenotipo dado se identificaron y cuantificaron utilizando el software TissueQuest (TissueGnostics), con valores de corte determinados en relación con los controles negativos (controles solos secundarios y no teñidos). La selección y la cuantificación de células positivas simples/dobles se llevaron a cabo utilizando estos umbrales.

Se emplearon imágenes de microscopía de rayos X (XRM) en ratones C57BL/6 (normales y OVX) para evaluar la estructura ósea y la formación de callos dentro del área lesionada. Las tibias (incluidos los tejidos blandos y los músculos) se recogieron y se fijaron en formalina tamponada neutra (NBF) al 10 % durante 24 h. Después de 24 h, todo el tejido blando y el músculo se extrajeron del hueso. Las muestras se colocaron en alcohol al 70 % hasta obtener imágenes XRM. Para preparar muestras para XRM, la tibia se retiró del alcohol y se aseguró con espuma en un soporte vertical. Se usó PBS para garantizar la hidratación durante la toma de imágenes. Se colocaron tres fantomas de calibración ósea de hidroxiapatita de calcio (CHA) (densidades 50, 1000 y 1200 mg/cm3) encima de una fina capa de espuma para asentarse al ras y asegurarlos al soporte con cinta adhesiva. Las exploraciones XRM de baja energía (voltaje de 40 kVp, potencia de 3 W) se realizaron utilizando un objetivo de 4 ×. El tiempo de exposición de cada proyección fue de 3 s, y se recogieron proyecciones de 2001 por rotación. Las imágenes se reconstruyeron a un tamaño de vóxel isotrópico de 4,9 μm. Los datos sin procesar obtenidos del escaneo XRM se procesaron utilizando el software Amira y scripts personalizados SimpleITK (v0.10.0, http://www.simpleitk.org/)21. Se segmentaron todas las rebanadas que contenían el defecto del orificio de trepanación, incluida el área hasta donde termina el hueso cortical y todo el callo óseo recién formado que se extiende desde el sitio del defecto (Fig. S3 complementaria). Las regiones de interés (ROI) se colocaron en los fantasmas de calibración de CHA evitando los artefactos de borde usando ITK-SNAP (v3.8.0, http://www.itksnap.org/)22. Se calculó la atenuación lineal promedio en cada ROI y se ajustó una ecuación de calibración lineal para calibrar las imágenes XRM. Para todas las calibraciones, R2 > 99%. Se utilizó un umbral de densidad de 800 mg/cm3 para segmentar el tejido completamente mineralizado. La fractura del volumen óseo del callo (BV/TV) se calculó como el número de vóxeles completamente mineralizados en la segmentación del callo dividido por el número total de vóxeles en la segmentación del callo. La densidad mineral ósea (DMO) del callo se calculó como la densidad promedio dentro de la segmentación del callo. Las representaciones de callos se generaron utilizando el software ParaView (5.7.0). Se aplicaron tres filtros: (1) Umbral, con un mínimo de 0,5, (2) Extraer superficie y (3) Suavizar, con 400 iteraciones.

Todos los datos se analizaron con GraphPad Prism 9. Todos los conjuntos de datos que contenían más de dos grupos experimentales se analizaron con un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con un intervalo de confianza del 95 % (α = 0,05) con una prueba post-hoc LSD de Fisher . Los conjuntos de datos que contenían solo dos grupos se analizaron mediante una prueba t paramétrica no pareada de dos colas con un intervalo de confianza del 95 % (α = 0,05).

Para validar que las iPSC modificadas mantuvieran la capacidad de diferenciarse en las tres capas germinales, se realizó un análisis de teratoma y se observaron tejidos derivados de las tres capas germinales, incluido el hueso (Fig. S4 complementaria).

Los andamios de colágeno I con iPSC se recolectaron durante 21 días de diferenciación in vitro y se analizaron para determinar la expresión de los marcadores osteogénicos Sp7, Bglap e Ibsp; marcadores condrogénicos Sox9 y Col2a1; marcadores pluripotentes Oct4 y Nanog (Fig. S4 complementaria). Las iPSC sembradas en andamio de colágeno I (a 100 000 células/100 μl) mostraron una mayor expresión de Sp7 Bglap e Ibsp. La expresión de Sp7 alcanzó su punto máximo en el día 1 de diferenciación en comparación con Bglap e Ibsp, que alcanzaron su punto máximo en los días 15 y 11 respectivamente (Fig. S4 complementaria). No se detectaron marcadores condrogénicos durante los primeros 7 días de diferenciación y luego se observó la expresión de Sox9 y Col2A1, alcanzando su punto máximo en el día 18 y 15 respectivamente (Fig. S4 complementaria). Si bien la expresión del marcador pluripotente (Oct4 y Nanog) se detectó en iPSC no diferenciadas, no se detectó ningún marcador el día 7 de diferenciación (Fig. S4 complementaria). La viabilidad de las células en el andamio de colágeno también se examinó durante el período de diferenciación mediante citometría de flujo. Las iPSC no diferenciadas eran ~ 97 % viables en el momento en que se sembraron en los andamios y esto disminuyó a ~ 72 % después de 5 días en el andamio (punto de tiempo del trasplante). Al final del período de diferenciación in vitro, ~ 15% de las células eran viables (Fig. S4 complementaria).

Antes de examinar la interacción de las MPC endógenas con las iPSC exógenas después de la lesión, se examinó la localización de las MPC Hic1+ rastreadas en el linaje en hueso no lesionado en ratones 7 días después de la inducción con tamoxifeno (Figura complementaria S5). En el hueso no lesionado, las MPC se localizaron en las superficies óseas (perióstico y endóstico). Dentro del hueso cortical, había pocas MPC Hic1+ y solo una pequeña fractura de estas expresaba BSP. Sin embargo, dentro de la cavidad de la médula ósea, hubo un aumento en la población Hic1+ con aprox. 10% de estas células que expresan sialoproteína ósea (BSP) y aprox. 20 % que expresa Ki67 (Figura complementaria S5A-F).

A los 3 (fig. 1) y 7 (fig. 2) días post-lesión sin tratamiento; Los MPC rastreados por linaje se enriquecieron en la región cortical de la lesión en ambos puntos de tiempo y en la cavidad de la médula ósea en el día 7 (Figs. 1, 2). Se observó la colocalización de tdTomato y BPS dentro de la cavidad de la médula, las superficies óseas endósticas adyacentes y el sitio de la lesión con el hueso cortical en ambos puntos de tiempo (Figs. 1, 2D-F, J). Si bien se observó una proliferación celular mínima (Ki67) dentro del sitio de la lesión el día 3, se observó una tinción robusta de Ki67 en todo el sitio de la lesión, incluida la cavidad de la médula ósea el día 7 (Figs. 1, 2G-I). A los 3 días posteriores a la lesión, solo una proporción menor de células positivas para tdTomato también expresaron Ki67 (Fig. 1G-I, K), con un aumento dramático en las células tdTomato y Ki67 doblemente positivas observadas el día 7 posterior a la lesión (Fig. 2G –I,K).

Rastreo de linaje de MPC a los 3 días posteriores a la lesión sin intervención. Se presenta la localización de los MPC rastreados del linaje Hic1+ (tdTomato D–I), BSP (D–F) y Ki67 (G–I). Una imagen representativa de safranina O muestra la presencia de tinción de proteoglicanos dentro del sitio de la lesión (A–C). Barras de escala en (A,D,G) = 200 μm, barras de escala en las cifras restantes = 100 μm. Puertas de citometría tisular representativas de los mismos grupos (J,K).

Rastreo de linaje de MPC a los 7 días posteriores a la lesión sin intervención. Se presenta la localización de los MPC rastreados del linaje Hic1+ (tdTomato D–I), BSP (D–F) y Ki67 (G–I). Una imagen representativa de safranina O muestra la presencia de tinción de proteoglicanos dentro del sitio de la lesión (A–C). Barras de escala en (A,D,G) = 200 μm, barras de escala en las cifras restantes = 100 μm. Puertas de citometría tisular representativas de los mismos grupos (J,K).

Cuando la lesión se trató solo con andamios de colágeno I (sin iPSC) (Figs. 3, 4A-C), se observaron MPC trazadas por linaje dentro del sitio de la lesión cortical, la cavidad de la médula y las superficies endósticas, así como la superficie perióstica del hueso en tanto el día 3 como el día 7 después de la lesión (Figs. 3, 4D-F). Se observó una tinción fuerte de BSP en todo el sitio de la lesión cortical y dentro de la cavidad de la médula ósea en ambos puntos de tiempo (Figs. 3, 4D-F). Si bien se observaron pocas células Ki67+ dentro del sitio de la lesión cortical en cualquier momento, se observaron células Ki67+ en la cavidad de la médula 3 días después de la lesión con una reducción aparente de células positivas el día 7 después de la lesión (Figs. 3, 4G-I ). Tanto a los 3 como a los 7 días después de la lesión, ~ 40–50 % de las células Hic1+ también expresaron BSP y ~ 20 % de esta población rastreada del linaje Hic1 fue proliferativa dentro del sitio de la lesión cortical (Figs. 3, 4J, K). Dentro de la cavidad de la médula ósea ~ 25% de las células Hic1+ también expresaron BSP y ~ 10% de esta población rastreada del linaje Hic1 fue proliferativa 3 días después de la lesión dentro del sitio de la lesión cortical (Fig. 3J, K). A los 7 días posteriores a la lesión (Fig. 4A-C), casi todas las células Hic1+ también expresaron BSP y ~ 60 % de esta población celular también expresó Ki67 (Fig. 4J, K).

Rastreo de linaje de MPC a los 3 días posteriores a la lesión con implantación de andamios de colágeno. Se presenta la localización de los MPC rastreados del linaje Hic1+ (tdTomato D–I), BSP (D–F) y Ki67 (G–I). Una imagen representativa de safranina O muestra la presencia de tinción de proteoglicanos dentro del sitio de la lesión (A–C). Barras de escala en (A,D,G) = 200 μm, barras de escala en las cifras restantes = 100 μm. Puertas de citometría tisular representativas de los mismos grupos (J,K).

Rastreo de linaje de MPC a los 7 días posteriores a la lesión con implantación de andamios de colágeno. Se presenta la localización de los MPC rastreados del linaje Hic1+ (tdTomato D–I), BSP (D–F) y Ki67 (G–I). Una imagen representativa de safranina O muestra la presencia de tinción de proteoglicanos dentro del sitio de la lesión (A–C). Barras de escala en (A,D,G) = 200 μm, barras de escala en las cifras restantes = 100 μm. Puertas de citometría tisular representativas de los mismos grupos (J,K).

Cuando los geles de colágeno se cargaron con iPSC y se implantaron en el sitio de la lesión, se observó una fuerte expresión de GFP en el sitio de la lesión cortical, así como dentro de la cavidad de la médula a los 3 días posteriores a la lesión (Fig. 5A-I) Se observó tinción de BSP durante todo el proceso. toda el área de la lesión y co-localizada con células positivas tanto para GFP (iPSC) como para tdTomato (MPC rastreadas por linaje) (Fig. 5D-F, J). En contraste con las lesiones no tratadas y las tratadas con colágeno I solo, se observó una tinción mínima de Ki67 dentro de las regiones corticales o de la cavidad de la médula con poca o ninguna coexpresión dentro de las células positivas para GFP o tdTomato (Fig. 5G-I, K). A los 7 días posteriores a la lesión (Fig. 6A-I), todavía se observaba la tinción de GFP en todo el sitio de la lesión, aunque se enriquecía en la cavidad de la médula ósea en comparación con el sitio de la lesión cortical. Se observaron pocas o ninguna célula tdTomato. También se observó tinción de BSP a lo largo de la lesión y se detectó la co-localización con la señal de GFP (Fig. 6D-F, J). Se detectó una expresión mínima de Ki67 y solo unas pocas células GFP o tdTomato expresaron Ki67 (Fig. 6G-I, K).

Rastreo de linaje de MPC en lesiones tratadas con iPSC dentro de andamios de colágeno I 3 días después de la lesión. Se inyectaron andamios de colágeno I que contenían 100 000 iPSC en las lesiones y los animales se sacrificaron 3 días después del tratamiento (A, B). Se examinó la localización de iPSC (GFP) y MPC trazadas con linaje Hic1+ (tdTomato) en relación con la tinción de BSP (D–F) o Ki67 (G–I). Barras de escala en (A,D,G) = 200 µm, barras de escala en las cifras restantes = 100 µm. Puertas de citometría tisular representativas de los mismos grupos (J,K).

Rastreo de linaje de MPC en lesiones tratadas con iPSC dentro de andamios de colágeno I a los 7 días posteriores a la lesión. Se inyectaron andamios de colágeno I que contenían 100 000 iPSC en las lesiones y los animales se sacrificaron 7 días después del tratamiento (A, B). Se examinó la localización de iPSC (GFP) y MPC trazadas con linaje Hic1+ (tdTomato) en relación con la tinción de BSP (D–F) o Ki67 (G–I). Barras de escala en (A,D,G) = 200 µm, barras de escala en las cifras restantes = 100 µm. Puertas de citometría tisular representativas de los mismos grupos (J,K).

Los marcadores celulares utilizados en el estudio se cuantificaron para determinar si el número o el destino de las poblaciones de progenitores endógenos (MPC) cambiaron después de la lesión dentro del área de lesión cortical y/o la cavidad de la médula con o sin la adición de iPSC exógenas (Fig. S6). En los controles no tratados, observamos un aumento en el número de células, MPC (tdTomato), MPC en proliferación (tdTomato+Ki67+) y MPC que asumen un destino osteoblástico (tdTomato+BSP+) desde el día 3 hasta el día 7 después de la lesión en la cortical. y regiones de la cavidad medular (Fig. S6A,B complementaria). Cuando se introdujeron los andamios de colágeno I, pareció haber un sesgo hacia la diferenciación frente a la proliferación, ya que se observaron menos células tdTomato+Ki67+, pero aún hubo un aumento en las células tdTomato+BSP+ dentro del sitio de la lesión (Figura complementaria S6C,D). Con la adición de iPSC exógenas en el andamiaje de colágeno I, se silenció la proliferación celular dentro de todo el sitio de la lesión, mientras que aún se observaron células BSP positivas. Sin embargo, parece que la mayoría de estas células BSP positivas se derivaron de las iPSC exógenas con poca contribución a la población BSP+ de las MPC endógenas (Figura complementaria S6E, F).

Para obtener una mejor comprensión de cómo las MPC endógenas reaccionan a la lesión en condiciones no homeostáticas, se indujo la lesión por perforación en ratones osteopénicos/poróticos (post-OVX). Se usó inmunofluorescencia para identificar la ubicación de los MPC rastreados por linaje 7 días después de la lesión. Los MPC trazados por linaje se observaron dentro del hueso cortical y la cavidad de la médula ósea con tinción también observada en las superficies óseas (perióstico y endóstico). Se observó la colocalización de tdTomato con BSP y Ki67 en la cavidad de la médula y también se observó la colocalización de tdTomato con BSP dentro del hueso cortical. Sin embargo, se observó una mínima expresión de Ki67 o colocalización con tdTomato en el hueso cortical (Figura complementaria S7A-H).

A los 7 días posteriores a la lesión y a los 14 días posteriores a la OVX (en ausencia de andamios de colágeno I ± iPSC), se observaron MPC trazadas por linaje dentro del sitio de la lesión del hueso cortical además de la cavidad de la médula ósea (Fig. 7A-I). Se observó la colocalización de tdTomato con BSP o Ki67 en todo el sitio de la lesión (Fig. 7A-K).

Rastreo de linaje de MPC en ratones OVX a los 7 días posteriores a la lesión sin intervención. Se presenta la localización de los MPC rastreados del linaje Hic1+ (tdTomato D–I), BSP (D–F) y Ki67 (G–I). Una imagen representativa de safranina O muestra la presencia de tinción de proteoglicanos dentro del sitio de la lesión (A–C). Barras de escala en (A,D,G) = 200 μm, barras de escala en las cifras restantes = 100 μm. Puertas de citometría tisular representativas de los mismos grupos (J,K).

Cuando los ratones OVX se trataron solo con andamios de colágeno I (sin iPSC) (Fig. 8)), se observó una expresión robusta de tdTomato en todo el sitio de la lesión (Fig. 8A-I). También se observó BSP en todo el sitio de la lesión con tinción intensa observada en las regiones de la cavidad cortical y de la médula (Fig. 8A-F). Si bien también se observó tinción de Ki67+ en todo el sitio de la lesión, la tinción se enriqueció en el área de la lesión cortical (Fig. 8G-I). Se observó la colocalización de tdTomato con BSP y Ki67 en las regiones de la cavidad cortical y de la médula (Fig. 8J-K).

Rastreo de linaje de MPC en ratones OVX a los 7 días posteriores a la lesión con implantación de andamios de colágeno. Se presenta la localización de los MPC rastreados del linaje Hic1+ (tdTomato D–I), BSP (D–F) y Ki67 (G–I). Una imagen representativa de safranina O muestra la presencia de tinción de proteoglicanos dentro del sitio de la lesión (A–C). Barras de escala en (A,D,G) = 200 μm, barras de escala en las cifras restantes = 100 μm. Puertas de citometría tisular representativas de los mismos grupos (J,K).

Cuando los andamios de colágeno se cargaron con iPSC y se implantaron en el sitio de la lesión, se observó la expresión de GFP tanto en el área de la lesión cortical como dentro de la cavidad de la médula (Fig. 9A-I). De manera similar a cuando se inyectaron iPSC en las lesiones de ratones intactos, se observó poca o ninguna tinción de tdTomato. Sin embargo, la tinción de BSP todavía se observó en todo el sitio de la lesión y se co-localizó con la expresión de GFP (iPSC) (Fig. 9J). Se observó poca o ninguna tinción de Ki67 en el sitio de la lesión (regiones corticales o de la cavidad de la médula) y se observó una colocalización mínima de Ki67 con la expresión de GFP (Fig. 9G-I, K).

Rastreo de linaje de MPC en ratones OVX tratados con iPSC dentro de andamios de colágeno I a los 7 días posteriores a la lesión. Se inyectaron andamios de colágeno I que contenían 100 000 iPSC en las lesiones de los animales que se sacrificaron 7 días después del tratamiento (A, B). Se examinó la localización de iPSC (GFP) y MPC trazadas con linaje Hic1+ (tdTomato) en relación con la tinción de BSP (D–F) o Ki67 (G–I). Barras de escala en (A,D,G) = 200 µm, barras de escala en las cifras restantes = 100 µm. Puertas de citometría tisular representativas de los mismos grupos (J,K).

Los marcadores celulares utilizados en el estudio se cuantificaron en ratones OVX (Fig. S8 complementaria). En las lesiones no tratadas, hubo un aumento en todos los tipos de células examinados en relación con el control no lesionado dentro de las regiones corticales y de la cavidad de la médula (Figura complementaria S8A, B). Con la adición del andamio de colágeno (solo) hubo una pérdida casi completa de células proliferativas (incluidas las MPC proliferativas), con un aumento simultáneo de MPC que asumieron un destino osteoblástico (tdTomato+BSP+) (Figura complementaria S8C,D) . Cuando se introdujeron las iPSC en el sitio de la lesión, se inhibió nuevamente la proliferación y las células BSP+ en las regiones corticales y de la cavidad de la médula se derivaron principalmente de las iPSC exógenas (Figuras complementarias S8E, F).

Para examinar si la pérdida de la homeostasis ósea (OVX) afectaba el comportamiento de las poblaciones madre/progenitoras endógenas y/o exógenas, se cuantificaron los marcadores celulares utilizados en el estudio (Fig. 10). Se observaron varias diferencias significativas en los grupos de tratamiento lesionados y no lesionados. En el hueso no lesionado, hubo una disminución en el número total de células (DAPI+) en el hueso cortical además de una disminución en las células proliferativas en el hueso post-OVX (Fig. 10A). En la cavidad medular del hueso OVX no lesionado, hubo una disminución del número de células que expresaban BSP y MPC trazadas por linaje que expresaban BSP (tdTomato+BSP+) (Fig. 10B) En las lesiones no tratadas, la única diferencia dentro del área cortical fue un aumento en el número de células BSP+ en los ratones OVX (Fig. 10C). En la cavidad de la médula de estos ratones OVX, hubo una disminución en las MPC, las células BSP+ y las MPC trazadas por linaje que expresaban BSP (Fig. 10D). No hubo diferencias en la proliferación en los ratones no tratados.

Cuantificación de poblaciones celulares dentro del sitio de la lesión de ratones intactos frente a OVX. Los datos de citometría de tejido se cuantificaron y los resultados se examinaron estadísticamente. Se cuantificó el número de poblaciones de células DAPI+, tdTomato+, BSP+, Ki67+, tdTomato+BSP+, tdTomato+Ki67, GFP+ iPSC, GFP+Ki67+ GFP+BSP+ en armazón de colágeno no lesionado (A,B) no tratado (C,D) (E ,F) y andamio de colágeno más grupos de tratamiento iPSC (G,H). ns = no significativo. * p < 0,05.

Cuando los andamios de colágeno I se implantaron en el sitio de la lesión, hubo un aumento espectacular en la cantidad de MPC, células BSP+ y MPC que expresaban BSP en el sitio de la lesión cortical de los ratones OVX (Fig. 10E). Curiosamente, hubo una disminución en el número de células proliferativas en la región cortical y un aumento de células proliferativas en la cavidad de la médula de los ratones OVX (Fig. 10E, F). Las diferencias más llamativas entre los ratones intactos y OVX que recibieron iPSC se encontraban en la cavidad de la médula donde hubo una disminución dramática en el número total de células y células BSP+ en ratones que se sometieron a OVX (Fig. 10H).

Se cuantificaron los parámetros óseos de la microscopía de rayos X para determinar el volumen de hueso nuevo que llenaba el sitio del defecto y la calidad del hueso formado. La fracción de volumen óseo (BV/TV) y la densidad mineral ósea (BMD) se calcularon y cuantificaron en todos los ratones (Figura complementaria S9). Hubo una disminución significativa en BV/TV a los 3 días posteriores a la lesión, seguido de un aumento significativo en el día 7. Se observó la misma tendencia en presencia del andamio de colágeno (Figura complementaria S9A). Cuando se introdujeron las iPSC, se observó una reducción drástica en BV/TV en los días 3 y 7 posteriores a la lesión (Figura complementaria S9A). Se observaron las mismas tendencias en la DMO para los ratones, los grupos de tratamiento y los puntos de tiempo (Fig. S9C complementaria). Cuando se compararon ratones intactos con ratones OVX, se observó una disminución en BV / TV y BMD en el hueso OVX no lesionado como se esperaba (Figura complementaria S9B, D). No se observaron diferencias en los grupos sin tratar y con andamiaje de colágeno I solo en términos de BV/TV, pero ambos grupos mostraron una DMO disminuida en los ratones OVX (Fig. S9B, D complementaria). Se observó un aumento significativo en BV/TV en ratones OVX tratados con iPSC en comparación con ratones intactos; sin embargo, los valores de BMD en los ratones mostraron el efecto opuesto (Figura complementaria S9B, D).

Este estudio se llevó a cabo para comprender mejor las interacciones entre las células madre/progenitoras endógenas y exógenas durante la cicatrización ósea. Usando un modelo altamente reproducible de lesión ósea (p. ej., agujero de burr) en ratones intactos/normales y osteoporóticos/osteopénicos (OVX), pudimos demostrar que existe una inhibición parcial del reclutamiento/función de MPC endógenas cuando se administran iPSC exógenas. Hasta donde sabemos, esta es la primera vez que se muestra este efecto y esta observación requiere más investigación para determinar si cambiar el modo de administración y/o la dosificación de células exógenas puede mitigar esta inhibición y/o incluso dar como resultado una sinergia entre células endógenas. y poblaciones exógenas.

Si bien es importante reconocer que el diseño de nuestro estudio no se llevó a cabo para optimizar/mejorar la curación de fracturas con iPSC, pudimos demostrar que la administración de iPSC dentro de un andamio de colágeno I modificado osteogénicamente resultó en una mejor curación de fracturas en un modelo de ratón deteriorado de homeostasis ósea (OVX). Estos resultados se alinean con estudios publicados anteriormente de nuestro laboratorio14 y otros23 que muestran que las células madre pluripotentes (de ratón o humanas) pueden facilitar la reparación de fracturas en modelos deteriorados. En los ratones normales, la fractura con orificio de trepanación no tratada se llenó de hueso muy rápidamente, como se esperaba7,12,24,25,26. Sin embargo, fue interesante encontrar que el tratamiento con andamiaje de colágeno I con o sin iPSC en un ratón intacto perjudicó el proceso de curación normal y dio como resultado medidas de resultado equivalentes o peores. Una posible explicación de esto es la presencia física del andamio denso que puede haber impedido el reclutamiento y/o la remodelación celular en el sitio de la lesión. Además de la interferencia física del colágeno, es muy posible que el reclutamiento de otros progenitores osteocondrales se haya visto afectado en presencia de iPSC y/u otras poblaciones celulares requeridas para la reparación/homeostasis ósea normal (como los osteoclastos). Además, en estas lesiones tratadas con iPSC, el hueso formado dentro del sitio de la lesión presentaba una morfología inmadura que carecía de una estructura trabeculada definida en comparación con los otros grupos de tratamiento. Sin embargo, no podemos estar seguros de que las propias iPSC contribuyeran directamente a este fenotipo óseo inmaduro, o simplemente retrasaran el proceso de curación natural en estos ratones. Además de una disminución en los MPC rastreados por linaje dentro de los defectos que recibieron iPSC, también observamos una tinción mínima de BSP y Ki67 en la población de MPC en comparación con los otros grupos de tratamiento (incluido el colágeno solo). Esto sugiere que fueron las iPSC las que cambiaron el comportamiento de los progenitores endógenos, inhibiendo efectivamente su capacidad de diferenciación proliferativa y osteogénica en este entorno de lesión y esto probablemente comprometió su capacidad para curar de manera efectiva el defecto del agujero de rebaba. En resumen, estos defectos de perforación tratados con iPSC formaron menos hueso que los grupos de control no tratados y los tratados con colágeno, lo que parecía ser una función de menos MPC, osteoprogenitores/osteoblastos comprometidos (BSP+) y células en proliferación en general (Ki67+). Este resultado es bastante interesante, ya que se ha demostrado previamente que las iPSC trasplantadas tienen la capacidad de aumentar la proliferación de células endógenas para efectuar la reparación27,28. Se necesitaría realizar un estudio diseñado específicamente para abordar esta observación directamente para determinar por qué esto no ocurre durante el proceso normal de reparación de lesiones óseas.

Comprender las implicaciones del uso de iPSC dentro del proceso de curación ósea es esencial para desarrollar terapias basadas en evidencia en el futuro. Sin embargo, también es fundamental determinar cómo interactúan estas células con las poblaciones endógenas en un modelo deteriorado de curación de fracturas óseas (OVX); ya que este entorno imita mejor la situación clínica en la que se emplearían estos tipos de terapias. El grupo tratado con andamio de colágeno I más iPSC demostró un aumento de BV/TV frente a los controles no tratados, pero no mostró diferencias en la DMO total. Por lo tanto, parecería que el tratamiento con iPSCs fue más eficaz en la formación de hueso nuevo en un modelo deteriorado de cicatrización ósea. Esto puede sugerir que se está produciendo una interacción osteoclasto-iPSC en los ratones intactos que también inhibe la respuesta de reparación natural y que esta interacción se interrumpe en el modelo OVX. También es posible que las iPSC trasplantadas puedan tener un destino osteoclástico, ya que se ha observado que los linajes osteoblásticos/osteoclásticos de las iPSC son más plásticos en las iPSC23. Otra observación interesante fue que en los ratones OVX tratados con el andamio de colágeno desprovisto de células presentaron muy poca regeneración ósea (menos BV/TV frente a iPSC) y el hueso que estaba presente parecía estar menos maduro y carecía de trabeculación definida. Además, todo el sitio de la lesión en estos ratones se tiñó intensamente positivo para BSP. Confirmamos que esto no era una consecuencia de la unión de anticuerpos secundarios no específicos. Esto sugiere que la señal BSP podría provenir de otras fuentes dentro del hueso o sistémicamente. Está bien documentado que la BSP está presente en la sangre y estos niveles pueden estar elevados debido a enfermedades29,30 como la osteoporosis31,32. Por lo tanto, es posible que el armazón de colágeno I por sí solo actúe como un "sumidero" para el aumento de los niveles sistémicos de BSP debido a la OVX, pero no está claro por qué no habríamos observado esto en el grupo de tratamiento con iPSC, a menos que el sistema sistémico los niveles de BSP se redujeron en este grupo. El análisis ELISA del suero arrojaría luz sobre esta hipótesis.

Como con cualquier estudio de investigación científica, existen limitaciones en el presente estudio. Si bien se ha demostrado que Hic1 es un marcador sólido de MPC15,16,17, al examinar únicamente las células que expresan Hic1, es probable que no tengamos en cuenta todas las subpoblaciones de MPC presentes en el ratón adulto. Por ejemplo, sería interesante determinar si el linaje Prx133 mostró el mismo comportamiento durante la reparación de fracturas con o sin iPSC. Otra limitación/factor de confusión potencial es el punto de tiempo del día 7 que se seleccionó en base a hallazgos previos de que se forma hueso trabecular en la cavidad medular una semana después de la cirugía de perforación en ratones normales y OVX14. Para desarrollar una comprensión más completa de la curación de la fractura ósea en el sitio de la lesión, sería valioso evaluar puntos de tiempo posteriores y/o usar modelos de fractura más complejos34.

En conclusión, la introducción de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) en una lesión ósea en ratones intactos condujo a una inhibición de la respuesta de reparación, pero aumentó la cantidad de hueso formado en ratones deteriorados (OVX). Específicamente, la introducción de iPSC en el sitio de la lesión en ratones intactos resultó en una disminución de la formación ósea, reducción del reclutamiento, proliferación y diferenciación de MPC endógenas. Además, la curación ósea que se observó en ratones OVX tratados con iPSC no fue el resultado de un mayor reclutamiento o diferenciación osteogénica de MPC endógenas, sino probablemente a través de la diferenciación de estas iPSC en osteoblastos. Se requiere investigación adicional para dilucidar mejor los mecanismos directos e indirectos a través de los cuales las iPSC participan en la curación ósea para que puedan emplearse de manera segura en la terapia basada en evidencia para el tratamiento de fracturas óseas sin unión difíciles de curar.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Descargar referencias

Leah Ferrie recibió el apoyo de una beca de Osteoporosis Canada. Priyatha Premnath recibió el apoyo de una beca de Alberta Innovates Health Solutions. Alexandra Olsen recibió el apoyo de una beca NSERC. Roman Krawetz cuenta con el apoyo de una Cátedra de Investigación de Canadá de Nivel 2. Este trabajo cuenta con el apoyo de subvenciones de NSERC y CIHR. Nos gustaría agradecer al personal del ARC de la Escuela de Medicina de Cumming por su ayuda con la cría de animales; y Kent Paulson por su ayuda con las pruebas biomecánicas.

Instituto McCaig para la Salud de los Huesos y las Articulaciones, Universidad de Calgary, Calgary, AB, Canadá

Leah Ferrie, Priyatha Premnath, Alexandra Olsen, Leila Larijani, Bryce A. Besler, Derrick E. Rancourt, Neil A. Duncan y Roman J. Krawetz

Programa de Posgrado en Ingeniería Biomédica, Universidad de Calgary, Calgary, AB, Canadá

Leah Ferrie, Alexandra Olsen, Bryce A. Besler, Derrick E. Rancourt, Neil A. Duncan y Roman J. Krawetz

Facultad de Ingeniería y Ciencias Aplicadas, Universidad de Wisconsin Milwaukee, Milwaukee, WI, EE. UU.

priyatha premnath

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Escuela de Medicina Cumming, Universidad de Calgary, Calgary, AB, Canadá

Leila Larijani y Derrick E. Rancourt

Departamento de Ingeniería Civil, Escuela de Ingeniería Schulich, Universidad de Calgary, Calgary, AB, Canadá

Neil A. Duncan

Departamento de Ciencias Celulares y Fisiológicas, Universidad de Columbia Británica, Vancouver, BC, Canadá

T. Michael Underhill

Departamento de Biología Celular y Anatomía, Escuela de Medicina Cumming, Universidad de Calgary, Calgary, AB, Canadá

Román J. Krawetz

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Concepción y diseño: LF, PP, RJK Análisis e interpretación de los datos: LF, AO, BAB, RJK Redacción del artículo: LF Revisión crítica del artículo para contenido intelectual importante: LF, PP, AO, LL, BAB, DER , NAD, TMU, RJK Aprobación final del artículo: LF, PP, AO, LL, BAB, DER, NAD, TMU, RJK Suministro de material de estudio: DER, TMU, RJK Obtención de financiación: RJK Recogida y montaje de datos: LF, AO, RJK

Correspondencia a Roman J. Krawetz.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Ferrie, L., Premnath, P., Olsen, A. et al. Las iPSC administradas de forma exógena interrumpen la respuesta de reparación natural de las MPC endógenas después de una lesión ósea. Informe científico 13, 9378 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36609-z

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Recibido: 07 julio 2022

Aceptado: 07 junio 2023

Publicado: 09 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36609-z

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